La suplementación con fibra protege de los antibióticos

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5161 (2023) Citar este artículo

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La disbiosis intestinal inducida por antibióticos (AID) es un efecto secundario frecuente y grave del uso de antibióticos y mitigar esta disbiosis es un objetivo terapéutico fundamental. Proponemos que la dieta del huésped puede modular el entorno químico del intestino, lo que resulta en cambios en la estructura y función del microbioma durante el tratamiento con antibióticos. La disbiosis intestinal se caracteriza típicamente por aumentos en el metabolismo bacteriano respiratorio aeróbico, el potencial redox y la abundancia de proteobacterias. En este estudio, exploramos los suplementos de fibra dietética como posibles moduladores del entorno químico en el intestino para reducir este patrón de disbiosis. Utilizando dietas definidas y secuenciación del genoma completo de microbiomas murinos femeninos durante la modulación de la dieta y el tratamiento con antibióticos, encontramos que los prebióticos de fibra redujeron significativamente el impacto del tratamiento con antibióticos en la composición y función del microbioma. Observamos una abundancia reducida de bacterias aeróbicas, así como de vías metabólicas asociadas con el metabolismo oxidativo. Estos resultados metatranscriptómicos se corroboran mediante mediciones químicas de eH y pH, lo que sugiere que la fibra amortigua los efectos disbióticos de los antibióticos. Este trabajo indica que la fibra puede actuar como un potencial terapéutico para la SIDA al modular el metabolismo bacteriano en el intestino para prevenir un aumento en el potencial redox y proteger a los microbios comensales durante el tratamiento con antibióticos.

Los antibióticos son una parte crucial de la medicina moderna que permite la defensa contra las infecciones, pero su uso a menudo resulta en daños colaterales al microbioma intestinal1,2,3. Esta EAI puede provocar complicaciones de salud como enfermedad inflamatoria intestinal, función inmune aberrante, infecciones y trastornos metabólicos4. Varios estudios han explorado métodos para disminuir el estrés antibiótico en el microbioma utilizando adsorbentes de fármacos orales y suplementos probióticos5,6.

Sin embargo, estos enfoques pueden reducir la eficacia de los fármacos o aumentar el desequilibrio intestinal en el caso de los probióticos6. En este trabajo, utilizamos la dieta para modificar el entorno químico intestinal e investigamos cómo los prebióticos de fibra pueden aliviar la SIDA al prevenir el aumento en el potencial redox intestinal observado después del tratamiento con antibióticos4,7,8.

El tipo de fuente de carbono en la dieta puede determinar qué aceptores de electrones llegan a las bacterias en el intestino provocando reacciones bioquímicas específicas y predecibles9,10,11. Por ejemplo, las fuentes simples de carbono presentes en la dieta occidental rica en azúcar son rápidamente absorbidas por el huésped, lo que limita el carbono para los microbios en el intestino. A medida que estos microbios compiten por el carbono limitado disponible, metabolizan el carbono derivado del huésped a partir de los revestimientos mucosos del intestino12,13. Como resultado, esto aumenta la inflamación intestinal y cambia la estructura del microbioma al seleccionar bacterias que prosperan en este ambiente inflamatorio y aeróbico14. Este entorno disbiótico puede proporcionar aceptores de electrones como O2, NO3, Fe3+ y seleccionar termodinámicamente reacciones metabólicas con mayor energía potencial redox11,15. Por otro lado, la fibra dietética selecciona microbios que pueden metabolizar polisacáridos complejos mediante el metabolismo fermentativo. Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) producidos por las bacterias mediante fermentación son metabolizados por los colonocitos en una reacción que consume oxígeno16,17,18. Como resultado de este ambiente anaeróbico, se favorecen termodinámicamente las reacciones metabólicas con menor energía potencial redox, como la fermentación.

Una perspectiva actual sobre la susceptibilidad bacteriana a los antibióticos sugiere que modificar el metabolismo podría proteger del estrés de los antibióticos. Varios estudios in vitro han probado esta hipótesis y han encontrado que reprimir el metabolismo microbiano disminuye la susceptibilidad a los antibióticos19,20,21,22. Estos estudios sugieren que la susceptibilidad está asociada con firmas de actividad metabólica como la regulación positiva del ciclo inútil, el recambio de ATP, un mayor potencial de membrana y un aumento de especies de radicales. Por el contrario, se ha demostrado que el pH elevado, el desacoplamiento del transporte de electrones y la disminución de la disponibilidad de glucosa suprimen el metabolismo microbiano y protegen de los antibióticos20,22. Este mecanismo de susceptibilidad impulsado por el metabolismo se ha investigado en gran medida in vitro; sin embargo, trabajos recientes también sugieren que la modulación del metabolismo de las bacterias intestinales en el huésped también podría afectar la SIDA.

Varios estudios recientes han comenzado a explorar el papel de la dieta del huésped en la SIDA. Se ha demostrado que las fibras derivadas de la dieta, como la goma xantana23, protegen de la disminución de la diversidad bacteriana que se observa después del tratamiento con antibióticos. Los estudios han comenzado a demostrar que una dieta de estilo occidental rica en grasas y azúcar puede exacerbar la SIDA2,3,24, y la suplementación in vitro con fibra prebiótica puede proteger a los comensales intestinales de los antibióticos. Estas asociaciones son prometedoras, pero existen importantes lagunas de conocimiento sobre los mecanismos detrás de las interacciones entre la dieta y los antibióticos in vivo. En este estudio, utilizamos la secuenciación metagenómica y metatranscriptómica del microbioma intestinal para adquirir datos de alta resolución de la composición y función bacteriana. Combinamos estos datos de secuenciación con mediciones químicas para proporcionar contexto para vías metabólicas enriquecidas. Descubrimos que la suplementación con fibra reducía la AID cuando se administraba antes, durante o después del tratamiento con antibióticos mediante un mecanismo impulsado por redox.

Utilizamos ratones hembra C57BL/6 para probar los efectos de la suplementación con fibra vegetal purificada sobre la AID en ratones alimentados con la dieta AIN-93G purificada (Envigo-Teklad). Esta dieta se prepara con un 80% de composición, lo que permite una suplementación del 20% de una fuente de carbono. Usamos glucosa como condición baja en fibra sin suplementos y un cóctel de 7 fibras vegetales que incluyen (celulosa, levano, dextrina, pectina, inulina, betaglucano, arabinoxilano) (Fig. 1a) para las condiciones suplementadas con fibra. Se eligió la glucosa como adición sin fibra para mantener las proporciones de carbohidratos: grasas: proteínas y reducir la accesibilidad a la microbiota. Las dietas libres de fibra suelen contener azúcares simples en lugar de polisacáridos complejos, como se muestra en Desai et al.25 y Kamada et al.26. Se utilizan azúcares simples porque son muy accesibles para el huésped y es probable que se procesen en el intestino delgado, lo que limita el acceso a la microbiota10. Además, la glucosa es un componente dietético común que puede tener menos efectos perjudiciales para el huésped que otros monosacáridos27, como la fructosa, que se ha demostrado que tiene toxicidad renal a corto plazo27.

Se utilizaron versiones modificadas de las dietas de roedores purificadas AIN-93G suplementadas con fibras purificadas para modular la fuente de carbono al microbioma intestinal. Los 0-fibra no recibieron ningún suplemento de fibra y se añadió 100% de glucosa en una proporción del 20% a la dieta. Los ratones suplementados con fibra recibieron un cóctel de 7 fibras vegetales purificadas en las proporciones mostradas. (a) Dieta del ratón y (b) esquema de intervención con antibióticos. La diversidad media de Shannon (n = 12 para el día 0,7) (n = 6 para los puntos de tiempo restantes) que se muestra para la Etapa 1 (rosa), la Etapa 2 (verde) y la Etapa 3 (púrpura) se muestran con intervalos SEM en control (c ). Las estrellas coloreadas corresponden a la magnitud del valor p según el modelo mixto bidireccional ANOVA & Dunnett. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Valores de p en el día 11: rosa – 0,0014, verde – 0,0118. Valores de p en el día 12: rosa – 0,0002, verde – 0,0004, morado 0,0309. Valores de p en el día 16: rosa – 0,0003, verde – 0,0006, morado 0,0003. Valores de p en el día 22: rosa – 0,0001, verde – <0,0001, morado 0,0207. Ratones tratados con antibióticos mostrados en (d). Valores de p en el día 8: rosa – 0,0452. Valores de p en el día 11: rosa – 0,0363, verde – 0,0060. Valores de p el día 12: verde 0,0428. Valores de p el día 22: verde 0,0001. Cada etapa se compara con una dieta sin suplementos y sin fibra. El tamaño del efecto antibiótico calculado con PERMANOVA en todas las etapas de suplementación se calculó utilizando los valores de distancia de Bray-Curtis y el método PCoA. La intensidad del color representa el valor p (se muestra la escala). Los resultados completos se muestran en los datos fuente (e). Abundancias relativas de familias bacterianas mostradas a lo largo del experimento (f).

Utilizamos la secuenciación longitudinal de ARNr 16S de las heces para evaluar la etapa óptima de suplementación con fibra en la recuperación posterior a la amoxicilina (150 mg / kg ad libitum en agua) (Fig. 1b). Se observaron diferencias de peso no significativas entre los grupos (Figura complementaria 1a). Se observó que la glucosa en ausencia de antibiótico disminuía la diversidad microbiana durante todo el experimento (Fig. 1c). La suplementación con fibra antes del tratamiento con antibióticos (AB) ([S1]:Antes) tuvo una reducción inicial significativamente menor (p <0,05) en la diversidad y una recuperación más completa en comparación con el grupo de glucosa (Fig. 1d). De manera similar, la suplementación con fibra durante el tratamiento con antibióticos ([S2]:Durante) también confirió una protección significativa tanto en la etapa de tratamiento (p <0,01) como en la de recuperación (p <0,001). Finalmente, la suplementación con fibra después del tratamiento con antibióticos ([S3]:Después) condujo a una mejor recuperación con un aumento en la diversidad microbiana en comparación con el grupo de glucosa (Fig. 1d). El tamaño del efecto de los antibióticos fue significativamente menor durante el tratamiento con suplementos de fibra (Fig. 1e) [S1]: Antes y [S2]: Durante. La suplementación con fibra después del tratamiento redujo los efectos de los antibióticos solo durante la recuperación (Fig. 1e). En consecuencia, encontramos que la suplementación con fibra en varias etapas provocó cambios significativos en la composición microbiana durante el tratamiento. Las características taxonómicas también indicaron una menor alteración del microbioma con la suplementación con fibra (Fig. 1f). Además de los datos anteriores, observamos que complementar fibras purificadas individualmente con una composición del 5% (Figura complementaria 1b) también fue beneficioso para la recuperación del microbioma después del tratamiento con antibióticos (Figura complementaria 1c-f). Estas observaciones implican que una modificación fina de la dieta puede afectar la recuperación del microbioma después del tratamiento con antibióticos. Desde una perspectiva traslacional, es particularmente beneficioso que la suplementación en el momento de la administración de antibióticos sea tan efectiva como antes del tratamiento.

Para ampliar la resolución taxonómica y funcional28,29 utilizamos la secuenciación metagenómica y metatranscriptómica del contenido cecal del ratón el día 1 y el día 5 después del tratamiento con antibióticos de un experimento replicado en el grupo [S2]:Durante (n = 6) (Fig. 2a). Los ratones tuvieron cambios no significativos en la histopatología intestinal el día 5 después del tratamiento con antibióticos (Figura complementaria 2a, Datos complementarios 1) o en la carga bacteriana el día 5 (Figura complementaria 2b). Aquí también encontramos que los ratones con dieta de glucosa tuvieron una disminución significativamente mayor en la diversidad alfa después de la administración de antibióticos en ambos momentos (Fig. 2b). Además, el tamaño del efecto de los antibióticos sobre la composición y función del microbioma a partir de datos metagenómicos y metatranscriptómicos respectivamente, tuvo un cambio mayor en ratones suplementados con glucosa en comparación con fibra el día 1 y el día 5 después del tratamiento con antibióticos (Fig. 2c, Fig. Suplementaria 2d-g). . La suplementación con glucosa se asoció con un mayor aumento de especies bacterianas en el filo Proteobacteria (rojo) en los datos metagenómicos y metatranscriptómicos, el día 1 y el día 5 después del tratamiento con antibióticos (Fig. 2d-g) (Datos complementarios 4). Para el día 5 del experimento, observamos que la glucosa tenía grandes cambios en la composición de especies y funcionaba en gran medida a partir de especies proteobacterianas (Fig. 2e, g). En los datos metagenómicos de lectura breve, los filos de Proteobacteria y Verrucomicrobia aumentaron en los ratones suplementados con glucosa (Fig. 2k, I) (Datos complementarios 3), mientras que la suplementación con fibra condujo a aumentos en Archaea y Actinobacteria (Fig. 2m, l). La asociación con las proteobacterias y la disbiosis14 sugiere que la alteración de los antibióticos se ve exacerbada por la glucosa y limitada por la fibra. Las especies de arqueas son sensibles a los ambientes aeróbicos30 y su aumento en abundancia con la suplementación con fibra sugiere que la fibra ayuda a mantener la anaerobicidad gastrointestinal (GI). Observamos patrones similares de cambios taxonómicos utilizando el ensamblaje de genes de novo de datos metagenómicos de lectura corta. Reunimos 54 genomas ensamblados en metagenomas (MAG) de alta calidad en nuestras muestras (Figuras complementarias 3a, b). Utilizando un análisis discriminante lineal de la abundancia relativa de MAG, identificamos cambios significativos en la composición del microbioma asociados con la suplementación con glucosa y fibra durante el tratamiento con antibióticos 5 días después de la administración de antibióticos (Figura complementaria 3g). Estos cambios concuerdan con el análisis de lectura breve (Figuras complementarias 3c a f) y sugieren que existen importantes diferencias de composición entre la suplementación con glucosa y fibra durante el tratamiento con antibióticos.

a Esquema del experimento con ratón (n = 6). b Caída de la diversidad D1 y D5 inducida por antibióticos durante el experimento en ratones suplementados con glucosa y fibra (n = 6). Kruskal Wallis con la corrección de Dunn. Día 1 Valor p ajustado de glucosa = 0,0031. Día 5 Valor p ajustado de glucosa = 0,0049. c Tamaño del efecto antibiótico calculado a partir de análisis PERMANOVA de distancias de Bray-Curtis utilizando el método PCoA a partir de conjuntos de datos metagenómicos y metatranscriptómicos (n = 6). El gráfico muestra el tamaño del efecto (tamaño del punto) con significado a partir de valores adj p indicados por estrellas de significado. Los resultados completos se muestran en los datos de origen. DESeq2 de especies significativas asociadas con cada grupo el día 1 y el día 5 del experimento a partir de datos metagenómicos (d, f) y metatranscriptómicos (e, g) del efecto antibiótico sobre la glucosa frente a la fibra. Las especies de proteobacterias están en rojo. log2 FC > 1 y p-adj <0,05 (n = 6). Resultados completos disponibles en información complementaria y visualizados en Rshiny (https://belenkylab.shinyapps.io/shiny). h Cambios en el filo Bacteroides en D1 y D5 del experimento, valor p ajustado = 0,0049. i Filo Verrucomicrobia, valor p ajustado = 0,0004. j Firmicutes filo k Proteobacteria filo, glucosa día 5 frente a fibra día 5 adj valor p = 0,0014, fibra día 1 frente a fibra día 5 adj valor p = 0,0478. l Filo Actinobacteria, valor p ajustado = 0,0330. m Archaea, valor p ajustado = 0,0002. Para h–m (n = 6) Media ± SEM Kruskal Wallis con corrección de Dunn *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Estudios previos in vitro e in vivo han identificado que un cambio en el metabolismo bacteriano tiene la capacidad de promover la tolerancia o susceptibilidad a los antibióticos. En general, el metabolismo activo se asocia con una mayor susceptibilidad, mientras que la latencia metabólica confiere protección1,19,21. Para determinar los cambios en la función metabólica en el microbioma intestinal, utilizamos la secuenciación metatranscriptómica de muestras cecales de ratón. Observamos firmas metabólicas únicas en los microbiomas intestinales de ratones alimentados con glucosa y fibra. Utilizando la base de datos del subsistema SEED, encontramos aumentos significativos en las vías involucradas en el metabolismo respiratorio en ratones suplementados con glucosa durante el tratamiento con antibióticos (p <0,05) (Fig. 3a, b). Por el contrario, la suplementación con fibra se asoció con un aumento de las vías metabólicas asignadas a la latencia, la fijación de carbono y el metabolismo de los ácidos grasos. Esto indica que la glucosa y la fibra tienen efectos divergentes sobre la bioenergética de las bacterias intestinales, y esto puede contribuir a las diferencias observadas en la respuesta taxonómica. Utilizando la base de datos HUMAnN3.0, identificamos aumentos significativos en las vías para la biosíntesis de peptidoglicanos en el día 1 después del tratamiento con antibióticos (Fig. 3d). Estos datos sugieren que las bacterias intestinales suplementadas con glucosa están entrando en un ciclo inútil de biosíntesis de peptidoglicano con un metabolismo hiperactivo. El ciclo de peptidoglicano se ha observado in vitro, pero aquí mostramos que las comunidades microbianas complejas in vivo siguen el mismo fenómeno19. Para el día 5 del experimento, la suplementación con glucosa condujo a una mayor expresión de las vías de biosíntesis de ácidos grasos, así como a la biosíntesis de hemo (Fig. 3e). La suplementación con fibra provocó aumentos en la biosíntesis de ubiquinol (Fig. 3d), así como un aumento en las vías de fijación de carbono anotadas como Calvin-Benson-Bassham (Fig. 3d) a pesar de la falta de maquinaria fotosintética en los MAG (secuencias de proteínas analizadas en Datos complementarios 2 ). El ciclo de ribulosa monofosfato (RuMP) es otra vía elevada de fijación de carbono que probablemente surge de la metanogénesis de Archaeal, que generalmente ocurre aguas abajo de la fermentación de la fibra (Fig. 3e). Tanto el ubiquinol como la biosíntesis del hemo ensamblan proteínas del grupo hierro-azufre para reacciones bioquímicas; sin embargo, un aumento en la biosíntesis del hemo sugiere que el entorno químico contiene transferencias de electrones de mayor energía31 potencialmente debido al aumento del metabolismo aeróbico. Esto se suma a los datos que muestran que la suplementación con glucosa promueve un ambiente gastrointestinal inflamatorio aeróbico.

Análisis DESeq2 del conjunto de datos metatranscriptómicos alineados con la base de datos SEED (n = 6). Aumentos significativos en las dietas D1 (a) y D5 (b) de glucosa (naranja) y fibra (azul) durante el tratamiento con antibióticos. Log2 FC ± SEM padj < 0,05 y log2 FC > 2. Se muestra el efecto antibiótico sobre la glucosa frente a la fibra. Resultados completos en Información complementaria. c Esquema de proteínas implicadas en el transporte de electrones bacterianos. Las vías significativas aumentaron en fibra (izquierda) y glucosa (derecha) según lo determinado por HUMAnN3.0 y MaAsLin2. Día 1 (n = 6) (d) y día 5 (n = 6) (e) qval = FDR, coeficiente mostrado en el eje x. Consulte Información complementaria para obtener resultados completos. Cambios significativos en la expresión de proteínas transportadoras de electrones (complejo 1, flavoproteínas, citocromos) alineadas con la base de datos Refseq D1 (n = 6) (f) y D5 (n = 6) (g) durante el tratamiento con antibióticos. padj < 0,0001 y log2 FC > 2. Log2 FC ± SEM. Se muestra el efecto antibiótico sobre la glucosa frente a la fibra. Resultados completos en Información complementaria.

Para comprender mejor este aumento en el metabolismo respiratorio, cuantificamos la expresión genética de proteínas involucradas en la cadena de transporte de electrones (ETC) (Fig. 3c). Utilizando el análisis de abundancia diferencial de lecturas transcriptómicas alineadas con la base de datos RefSeq (Datos complementarios 6), encontramos que la glucosa se asoció significativamente con una mayor actividad de ETC durante la exposición a antibióticos.

La expresión del complejo 1, flavoproteínas y citocromos fue mayor en ratones suplementados con glucosa después del tratamiento con antibióticos (p <0,0001) (Fig. 3f, g). Estas proteínas del grupo hierro-azufre son cruciales para las reacciones de transferencia de electrones de conversión de energía que las bacterias utilizan para obtener energía15. La disminución general de estas transcripciones en la dieta con fibra sugiere que esta comunidad tiene menos metabolismo respiratorio. Como control interno, utilizamos la subunidad beta de la ARN polimerasa como gen de mantenimiento y no encontramos diferencias significativas entre ningún grupo (Datos complementarios 5).

Cuantificamos la expresión del gen de resistencia a los antibióticos (ARG) en nuestros grupos de tratamiento y descubrimos que la dieta con fibra tenía una mayor expresión de ARG de especies proteobacterianas en comparación con la glucosa (Figura complementaria 4). Sin embargo, a pesar de este patrón de expresión de ARG, la abundancia de proteobacterias disminuye hacia el día 5 del experimento, lo que fortalece el papel del metabolismo bacteriano en los fenotipos observados.

Para dilucidar mejor el mecanismo detrás de este cambio metabólico en respuesta a las dietas probadas, utilizamos HUMAnN3.0 y MaAsLin2 para identificar cambios en los procesos bioquímicos en toda la escala bioenergética asociados con las dietas bajo tratamiento con antibióticos. Desenredar el metabolismo y la bioenergética en el microbioma intestinal es un desafío debido a la comprensión limitada de la bioquímica bacteriana de las muchas especies no cultivables en el intestino. Sin embargo, grandes cambios en las bacterias con funciones variables en la ecología metabólica del intestino pueden predecir con precisión la bioquímica intestinal8,11,32. En este estudio, buscamos en nuestro conjunto de datos metatranscriptómicos reacciones bioquímicas basadas en aceptores de electrones y potencial redox. Observamos un aumento significativo de la transcripción de vías que involucran oxígeno y nitrato como aceptores terminales de electrones después del tratamiento con antibióticos (Fig. 4a) en la dieta con glucosa en comparación con la dieta con fibra. También observamos un aumento de la respiración y la actividad de ETC, lo que indica un mayor metabolismo oxidativo (Fig. 4f, g) (Fig. 6a complementaria, Datos complementarios 8). Este aumento en el potencial redox intestinal selecciona termodinámicamente una mayor actividad respiratoria y restringe la actividad bioquímica de las bacterias que dependen predominantemente del metabolismo fermentativo. Múltiples estudios han encontrado que los comensales intestinales asociados con una mejor salud utilizan la fermentación para crear ácidos grasos de cadena corta y mantener un ambiente anaeróbico en el intestino33,34. Encontramos que la suplementación con fibra se asoció con una mayor expresión de enzimas activas en carbohidratos34 (CAZymes) que estaban involucradas en la degradación de polisacáridos. El cóctel de fibras se asoció con una mayor expresión de CAZimas totales, así como de CAZimas específicas de fibra involucradas en la degradación de pectina e inulina (Figuras complementarias 5a, b). Esto indica que el microbioma de los ratones suplementados con fibra tiene una mayor expresión de enzimas que podrían contribuir con sustratos para la fermentación.

( a ) Diferencias significativas en la expresión de la reacción HUMaN3 durante el D5 del experimento en la torre redox según lo determinado por MaAsLin2. El coeficiente que se muestra en el eje x y el tamaño del punto representa q-val = FDR. Resultados completos en Información complementaria. (b) Mapa de calor que muestra la abundancia de MAG que contienen el complejo 1 D1 y D5 (c) durante el experimento. Los cuadros blancos representan valores fuera de la escala. Cambio en la abundancia de MAG del complejo 1 mostrado con Mann-Whitney de dos colas para significancia D1, valor p de glucosa = 0,0043, valor p de fibra = 0,0087 (d) y D5, valor p de glucosa = 0,0022, valor p de fibra = 0,0260 (e) del experimento (n = 6) *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. (f) Cambios en la expresión de superóxido dismutasa, valores ajustados de p de izquierda a derecha = 0,0009, 0,0023, 0,0374, 0,0005. Cambios en la expresión de NAD (P) H deshidrogenasa (quinona), valores ajustados de p de izquierda a derecha = 0,0033, 0,0119, 0,0268, 0,0006. (g) Cambios en la expresión de la nitrato reductasa (citocromo), valores ajustados de p de izquierda a derecha = 0,0478, <0,0001, 0,0478, 0,0240, 0,0449, 0,0081, 0,0161. Para f, g: (n = 6) Copm = copias por millón de lecturas. Media ± SEM de Kruskal Wallis con corrección de Dunn *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. (h) valores de eH y pH de un experimento adicional con ratones (n = 6). Significancia media ± SEM determinada mediante la prueba de Mann-Whitney de dos colas, valores de p de izquierda a derecha = 0,0080, 0,0078, 0,0080. (i) Diagrama de Pourbaix que muestra los valores de eH y pH del contenido cecal liofilizado de ratones con y sin antibióticos medidos dentro de las 24 h posteriores a la rehidratación con agua RO. (j) Esquema de conclusiones.

El análisis discriminante lineal identificó firmas metabólicas similares a nivel de vía. La fibra se asocia con un aumento de las vías de fijación de carbono clasificadas como ciclo de Calvin-Benson-Bassham (Figura complementaria 7b, Datos complementarios 7) y vías involucradas en una mayor producción de coenzima A (Figura complementaria 7b, d), que podría ser otro indicador de aumento de la fijación de carbono. Además, las vías metabólicas exclusivas de un entorno anaeróbico se asociaron significativamente con el grupo de fibra, lo que sugiere que esta dieta reduce el oxígeno en el intestino y protege del metabolismo respiratorio. Este aumento en la fijación de carbono podría deberse al aumento de CO2 sobre O2, como sugiere un estudio reciente que explora las vías del ciclo inverso del TCA encontradas en bacterias35,36. Estos datos contrastan con las vías oxidativas aeróbicas inducidas en la dieta glucosada. Las vías oxidativas catabólicas como la glucólisis, el TCA y la vía de las pentosas fosfato (Figuras complementarias 7a, c) se asociaron con la dieta de glucosa en el día 5 del experimento. En resumen, la dieta con glucosa está más asociada con el metabolismo oxidativo catabólico mientras que la dieta con fibra se asoció con el metabolismo reductivo anabólico. Esto sugiere que la suplementación con fibra puede estimular el metabolismo fermentativo protector al reducir el potencial redox intestinal y el oxígeno y conducir a la protección contra el metabolismo respiratorio dañino que se observa después del tratamiento con antibióticos.

Los datos transcriptómicos sugieren que la actividad de ETC, específicamente el complejo 1, está involucrada en el cambio metabólico observado en nuestros datos. Estudios filogenómicos recientes han encontrado que aproximadamente el 50% de las bacterias tienen el complejo 137,38, y en su mayoría pertenecen al filo Proteobacteria. La presencia del complejo 1 puede ser un indicio de su capacidad bioenergética. El complejo 1 contiene grandes grupos de hierro y azufre que hacen que esta proteína sea responsable de las transferencias de electrones de alta energía. Con base en el aumento significativo observado en los genes para las subunidades del complejo 1 (Fig. 3f, g) (Fig. 6a complementaria) y el cambio mayor en el potencial redox (Fig. 4a), planteamos la hipótesis de que la glucosa puede estar impulsando la composición de la comunidad. para una mayor abundancia de bacterias del complejo 1. Para comprender cómo el cambio metabólico observado en las dietas respectivas contribuía a la composición de la comunidad, utilizamos Phylophlan3.0 para buscar en nuestros 54 MAG la presencia del complejo 1. Encontramos 6 MAG en nuestro conjunto de datos que determinamos que contenían el complejo 1 y observamos cambios significativos en su abundancia relativa. En comparación con la abundancia del complejo 1 en todos los genomas bacterianos, el ambiente anaeróbico del intestino probablemente explica la menor abundancia en nuestras muestras (6/54). Descubrimos que ambas dietas provocaron un aumento en las bacterias del complejo 1 1 día después del tratamiento con antibióticos (Fig. 4b, d), específicamente en la subunidad I (Fig. 6 complementaria). Sin embargo, para el día 5 del experimento, la dieta con glucosa continuó teniendo una mayor abundancia de bacterias del complejo 1 en comparación con el control, mientras que la dieta con fibra tuvo una disminución (Fig. 4c, e) (Fig. 6 complementaria). Es importante señalar que este aumento se limitó a 4 de los 6 MAG identificados que contienen el complejo 1. Los MAG clasificados en Muribaculaceae y Bacteroidales no exhibieron un aumento en la abundancia inducido por antibióticos. Aunque la presencia del complejo 1 puede mejorar la supervivencia en un entorno con alto nivel redox, muchos otros factores pueden desempeñar un papel en la aptitud de una bacteria, como los genes de resistencia a los antibióticos, la tasa de crecimiento y la competencia por las fuentes de carbono. El entorno del intestino también crea gradientes químicos y tiene una organización espacial específica de bacterias que impulsan la composición11,12. Debido a esta heterogeneidad, es posible que el entorno redox no tenga los mismos efectos en todas las bacterias que se encuentran en el intestino. Aquí, identificamos que la suplementación con glucosa puede aumentar el redox intestinal, lo que hace que la composición del microbioma contenga bacterias más complejas en comparación con una dieta suplementada con fibra. Estas bacterias contribuyen de manera importante al cambio metabólico hacia el metabolismo respiratorio aeróbico que se observa con la suplementación con glucosa durante el tratamiento con antibióticos (Fig. 4f, g) (Fig. 8a-d complementaria).

Hasta ahora nos hemos basado en métodos de secuenciación para comprender el entorno redox intestinal en dietas con glucosa y fibra. Para evaluar si los cambios observados en nuestros datos metagenómicos y metatranscriptómicos se traducen en cambios fisiológicos en el intestino, utilizamos métodos publicados para medir el potencial químico redox en el contenido cecal de nuestros ratones4,32,39,40,41. Primero validamos estos métodos en ratones que recibieron una dieta estándar y descubrimos que los antibióticos aumentaban el potencial redox químico (Figuras complementarias 9a a f). Estos resultados corroboran con otros estudios que miden el efecto de los antibióticos sobre el potencial redox4. Luego medimos el potencial químico redox del contenido cecal de ratones que recibieron nuestras dietas de glucosa y fibra 5 días después del tratamiento con antibióticos. Elegimos este momento en función de los datos de secuenciación que sugirieron grandes cambios en la utilización del complejo 1 para el día 5 del experimento. Descubrimos que solo la dieta con glucosa después del tratamiento con antibióticos se asoció con un aumento significativo en el potencial redox intestinal (Fig. 4h) (Fig. 9g-i complementaria). Debido a que el potencial redox (eH) también se ve afectado por el pH del medio ambiente32, los medimos en paralelo y mapeamos los datos en un diagrama de Pourbaix (Fig. 4i). Estos datos sugieren que la dieta altera drásticamente el entorno químico del intestino, lo que contribuye a cambios en la actividad bioquímica de los microbios intestinales. Las mediciones de ATP de estas muestras mostraron cambios no significativos entre los grupos de control y tratados con antibióticos (Figura complementaria 9j, k). Los cambios inducidos por antibióticos en el ambiente químico del intestino fueron más significativos en la dieta con glucosa en comparación con la dieta con fibra, lo que indica la capacidad protectora de la fibra para amortiguar el redox intestinal.

El mecanismo de susceptibilidad impulsado por el metabolismo propone que el metabolismo catabólico activo en las bacterias puede afectar su susceptibilidad a los antibióticos21. La mayoría de los estudios microbianos hasta ahora han documentado este fenómeno in vitro. En este estudio, exploramos el vínculo entre el metabolismo y la susceptibilidad a los antibióticos en la compleja población del microbioma intestinal. Mostramos cómo los aportes dietéticos al microbioma intestinal pueden alterar la producción bioquímica de los microbios coincidiendo con amplios cambios en el entorno químico intestinal. Específicamente, observamos que alterar el metabolismo bacteriano mediante la suplementación dietética con fibra puede proteger contra los efectos negativos de los antibióticos (Fig. 4j).

Nuestro trabajo demuestra grandes cambios metagenómicos, metatranscriptómicos y químicos dependientes de la dieta en la estructura y función del microbioma durante el tratamiento con antibióticos. Los métodos multiómicos empleados en este estudio están bien establecidos en el campo; sin embargo, las mediciones químicas del microbioma aún se encuentran en sus primeras etapas. Si bien existen estudios limitados que miden el potencial redox intestinal y el pH, estos métodos requieren mejoras adicionales. Idealmente, el potencial redox debería medirse a lo largo del tiempo dentro del entorno intestinal. Esto sólo es posible con sensores inalámbricos in vivo como se muestra en Baltsavias et al.32. Se requieren más estudios para dilucidar la dinámica de los cambios potenciales redox en respuesta a la modificación de la dieta para comprender los mecanismos detallados implicados en la protección antibiótica. Intrínseco a cualquier modulación dietética, eliminar un componente como la fibra requiere la adición de un reemplazo para mantener una composición nutricional equivalente. Es difícil identificar un sustituto ideal, ya que la mayoría de los aditivos alimentarios seguros para los animales pueden ser metabolizados por el huésped o el microbioma. En esta publicación, elegimos la glucosa como suplemento bajo en fibra. Sin embargo, es importante señalar que esto no es un verdadero control sino más bien una condición dietética libre de fibra contrastante25,26.

Además, centramos este estudio en la actividad de los microbios intestinales y no aclaramos el papel de la contribución del huésped al entorno químico gastrointestinal. Se ha descrito anteriormente que una dieta baja en fibra y alta en azúcares es perjudicial para el huésped, lo que provoca un aumento de oxígeno en el gastrointestinal y cambios en la respuesta inmunitaria. Se ha demostrado que esto disminuye la eficacia de la vacuna42 en humanos, lo que sugiere que la dieta tiene importantes impactos inmunológicos. Estos estudios sugieren que la glucosa por sí sola tiene vastos efectos fisiológicos en el huésped que pueden afectar el ambiente gastrointestinal. En este estudio, no identificamos si los cambios en el ambiente intestinal son provocados directamente por el componente de la dieta, el procesamiento de la dieta por parte del huésped o mediante la actividad de la microbiota en la dieta.

Sin embargo, no vemos diferencias significativas en la morfología del tejido o la producción de citocinas (Figura 10 complementaria) entre grupos, posiblemente debido a que la duración del experimento se limitó a 5 días. Aunque existen diferencias no significativas en la morfología o la producción de citoquinas, es probable que existan consecuencias metabólicas para las células huésped como resultado de la suplementación con glucosa que pueden afectar indirectamente la función del microbioma. Hemos incluido análisis de expresión diferencial adicionales de nuestros datos 'ómicos para comparar los efectos del microbioma provocados por las dietas solas sin antibióticos, y hemos agregado estos datos a una aplicación interactiva Rshiny (https://belenkylab.shinyapps.io/shiny). Esto permitirá una mejor interpretación de los cambios iniciales del microbioma de las dietas respectivas.

Este trabajo logra avances importantes al vincular los cambios en el potencial redox inducido por la dieta y la actividad microbiana resultante con la susceptibilidad diferencial a los antibióticos. Los próximos pasos importantes son establecer la causalidad entre los cambios en el potencial redox y la susceptibilidad a los antibióticos en el contexto del huésped. Los estudios futuros pueden orientar la investigación hacia los efectos de la dieta directamente sobre el metabolismo de la célula huésped en relación con los cambios del microbioma y determinar si las diferencias observadas se trasladan a ratones macho. El metabolismo es intrínsecamente un acto de equilibrio entre el crecimiento y las consecuencias tóxicas de esta actividad. Esperamos que las futuras terapias contra el SIDA puedan apuntar a este equilibrio metabólico para lograr resultados terapéuticos óptimos sin morbilidad relacionada con el microbioma.

Todos los procedimientos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Brown bajo el número de protocolo IACUC 1706000283. Se adquirieron ratones hembra C57BL/6J de cuatro semanas de edad de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Los ratones se habituaron durante dos semanas después de su llegada a la Universidad de Brown. Todos los animales se alojaron juntos en condiciones libres de patógenos específicos (SPF), temperatura controlada (21 + 1,1 ° C), 30-70% v de humedad y condiciones de ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Los ratones fueron asignados al azar a nuevas jaulas después del período de habituación. Los ratones recibieron las dietas especificadas en forma de polvo. Los ratones utilizados en (Figuras complementarias 9a a f) para mediciones del potencial redox recibieron la comida de laboratorio típica (Laboratory Rodent Diet 5001, LabDiet, St. Louis, MO, EE. UU.).

Se diseñaron dietas purificadas con veterinarios de Envigo-Teklad (Madison, WI, EE. UU.) en función del contenido de fibra presente en la comida típica de laboratorio para ratones. La dieta se basa en la dieta AIN-93G(TD.180901) purificada, ampliamente utilizada, y modificada para contener carbohidratos reducidos, con la celulosa eliminada por completo y la maicena reducida. Además, la maicena suministrada en la dieta (maicena de búfalo, Envigo-Teklad) se modifica para que sea más accesible al huésped, lo que reduce su prevalencia en el ciego y el tracto gastrointestinal inferior. Esta dieta fue diseñada a medida con una composición del 80% para permitir una suplementación del 20% (p/p) con otras fuentes de carbono sin afectar las proporciones de proteínas, grasas, vitaminas y minerales. La dieta se pulveriza, se irradia y se administra a los ratones en frascos de alimentación. A los ratones se les asignaron 5 g/ratón por día en los frascos y la comida se reponía diariamente en frascos de alimentación nuevos esterilizados en autoclave. Esta cantidad se determinó después de conversaciones con los veterinarios de Envigo-Teklad y supera con creces la cantidad típica consumida por los ratones. La dieta de glucosa se utilizó sin fibra en todos los experimentos y se complementó con un 20% de glucosa (Fisher Scientific). La dieta de fibra contiene un 20%(p/p) de suplemento de un cóctel de fibra personalizado que incluye inulina (15%) (Chem-Impex), pectina (15%) (MP Biomedicals), dextrina (15%) (Sigma-Aldrich), levan (15%) (Realbiotech CO., Ltd), arabinoxilano (20%) (Anthony's Organics), betaglucano (25%) (Anthony's Organics), celulosa (10%) (EMD Millipore). Para la suplementación con fibra purificada única en la Fig. 1 complementaria, se utilizó una composición del 95 % de la misma dieta con una suplementación del 5 % (p/p) de pectina o inulina.

A los ratones C57BL/6J después del período de habituación se les dio 1 semana para aclimatarse a la dieta sin fibra con 20% (p/p) de glucosa. Después de este período de aclimatación a la dieta, los ratones se asignaron al azar a nuevas jaulas para cada condición de dieta/antibiótico. La amoxicilina se administró a través del agua potable (25 mg/kg/día) ad libitum durante los momentos especificados. Toda el agua potable se esterilizó por filtración antes de la administración. Se recogieron muestras fecales en los momentos especificados y se almacenaron a -20 °C hasta la extracción del ácido nucleico. El contenido del ciego se recogió directamente en tubos de bolas con protector de ADN/ARN (Zymo Research (Irvine, CA, EE. UU.) y se almacenó a -80 °C para la extracción de ácido nucleico. Para el eH, las mediciones de pH, el contenido cecal total se congeló inmediatamente. en nitrógeno líquido y liofilizado y almacenado a -80 ° C hasta que se tomaron las medidas.

Los ácidos nucleicos totales (ADN y ARN) se extrajeron de las muestras utilizando los kits ZymoBIOMICS DNA Miniprep de Zymo Research (Irvine, CA, EE. UU.) utilizando los protocolos de extracción según las instrucciones del fabricante. Para las muestras fecales se utilizó el kit de extracción de ADN Fecal 96 Zymo. Para la extracción paralela de ADN/ARN se utilizó el kit Zymo Magbead DNA/RNA. El ADN total se eluyó en agua libre de nucleasas y se cuantificó utilizando dsDNA-HS en un fluorómetro QubitTM 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) antes de su uso en preparaciones de amplicones/biblioteca.

La región hipervariable 16S rRNA V4 se amplificó a partir del ADN total utilizando el cebador directo 515F con código de barras y los cebadores inversos 806R del Earth Microbiome Project43. Los amplicones se generaron utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion 5X en las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 98 °C durante 30 s, seguida de 25 ciclos de 98 °C durante 10 s, 57 °C durante 30 s y 72 °C. durante 30 s, luego una extensión final a 72 °C durante 5 min. Se utilizó electroforesis en gel para visualizar amplicones y se agruparon en cantidades equimolares. La biblioteca de amplicones agrupada se envió al Centro de secuenciación y genómica de Rhode Island de la Universidad de Rhode Island (Kingston, RI, EE. UU.) para su secuenciación en la plataforma Illumina MiSeq. Los amplicones se secuenciaron en pares (2 × 250 pb) utilizando el kit de 600 ciclos con protocolos estándar.

Las lecturas de ARNr 16S sin procesar se demultiplexaron primero con idem. Filtrado de calidad, recorte, eliminación de ruido con DADA244 (q2-dada2) y fusión utilizando el canal Qiime2 (versión 2019.10)45. Las variantes de la secuencia ribosómica se alinearon con mafft46 (alineación q2) y la construcción del árbol filogenético se realizó con fasttree247 (filogenia q2). La asignación taxonómica se realizó utilizando el clasificador Naive Bayes previamente entrenado y el clasificador q2feature48 entrenado en la base de datos SILVA 132 99%49. La diversidad alfa (Shannon, diversidad filogenética de Faith) y la diversidad beta (disimilaridad de Bray-Curtis) se calcularon utilizando el paquete phyloseq50 (versión 1.30.0) en R (versión 3.6.2)50,51.

Se prepararon bibliotecas de secuenciación metagenómica y metatranscriptómica como se describe en la ref. 2 Cabral 2020. Para las bibliotecas metagenómicas se utilizaron 100 ng de ADN con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext® Ultra II FS (New England BioLabs, Ipswich, MA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante para generar un conjunto de fragmentos a 300 pb ± 50 pb. Se crearon bibliotecas metatranscriptómicas con ARN total (1 μg) utilizando el kit MICROBExpress (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.), el kit de agotamiento de ARNr NEBNext® para humanos/ratones/ratas (New England BioLabs, Ipswich, MA, EE. UU.) y el Kit de preparación de secuenciación de ARN NEBNext® Ultra II Direction según las instrucciones del fabricante para generar un conjunto de fragmentos a 300 pb ± 50 pb. Las bibliotecas metagenómicas y metatranscriptómicas se secuenciaron por pares (2 × 150 pb) en Illumina HiSeq X Ten. Un promedio de 12.928.385 lecturas por muestra metagenómica y 52.848.755 lecturas por muestra metatranscriptómica. Se creó una biblioteca de secuenciación metagenómica de control utilizando Zymobiomics Microbial Community Standard (D6300, Zymo Research) (Irvine, CA, Estados Unidos) y se agregó a la secuenciación. Estos datos se utilizaron para validar la precisión de la secuenciación. La secuenciación de este estándar dio como resultado abundancias relativas cercanas a la composición teórica con todos los miembros de la comunidad identificados.

Los genomas ensamblados en metagenoma a partir de lecturas metagenómicas se construyeron utilizando el proceso metaWRAP52. Las lecturas sin procesar se procesaron utilizando el módulo READ_QC con FASTQC 0.11.8 y TrmGalore 0.5.0. El montaje se realizó con el módulo ASSEMBLE en metaWRAP con metaSPAdes 3.13.053 y MegaHit 1.1.354. Los contigs ensamblados se agruparon con el módulo BINNING usando CONCOCT 1.0.0, MaxBin2 2.2.655 y metaBAT2 2.12.156. El módulo BIN_REFINEMENT y BIN_REASSEMBLY se utilizó para consolidar contenedores y seleccionar contenedores con más del 90 % de finalización y menos del 10 % de contaminación para lograr 54 MAG de alta calidad. La cuantificación se realizó utilizando el módulo QUANT_BINS con SALMON 0.13.157 y se clasificó con el módulo CLASSIFY_BINS y taxator-tk 1.3.3e. Para mejorar la clasificación de los contenedores también se utilizó la herramienta CAT and BAT 2021-01-0758,59,60.

Se utilizó PhyloPhlAn 3.031 para construir un árbol filogenético a partir de los MAG ensamblados utilizando la opción de alta diversidad y la base de datos PhyloPhlAn. Para identificar MAG con el complejo 1, se construyó una base de datos de filoflano personalizada utilizando los grupos de secuencias Uniref90 para cada una de las 14 subunidades (A – N) de la NADH-quinona oxidorreductasa bacteriana. Los datos complementarios 2 contienen el ID del clúster y la información sobre el tamaño. Luego se ejecutó PhyloPhlAn utilizando esta base de datos para construir un árbol filogenético de MAG para identificar MAG complejos 1.

Las lecturas metagenómicas y metatranscriptómicas sin procesar se recortaron y descontaminaron utilizando KneadData (versión 0.6.1) como se describió anteriormente 1,2,32. Las secuencias del adaptador Illumina se eliminaron usando Trimmomatic 56 (versión 0.36), luego se agotaron las lecturas asignadas a C57BL/6J, el virus del tumor mamario murino (MMTV, acceso NC_001503) y el virus del osteosarcoma murino (MOV, acceso NC_001506.1) usando Bowtie2 (versión 2.2) 1,57. Las lecturas metatranscriptómicas además se agotaron de secuencias que se alinearon con las bases de datos de ARN ribosómico SILVA 128 LSU y SSU Parc como se describió anteriormente 1,2.

La clasificación de las lecturas metagenómicas se realizó con NCBI RefSeq usando Kraken2 (versión 2.0.7-beta, “Kraken2 Standard Database”) con una longitud de k-mer de 35 (Wood et al.61). Luego se utilizó Bracken (versión 2.0.0) para calcular las abundancias a nivel de filo y especie a partir de informes Kraken2, y se utilizó el paquete R phyloseq (versión 1.28.0) para calcular las métricas de diversidad a y b62.

Una versión modificada del proceso de Anotación simple de metatranscriptomas mediante análisis de secuencias 2 (SAMSA2) para anotar lecturas recortadas y descontaminadas como se describió anteriormente1,63,64. Esta canalización modificada utiliza la utilidad Paired-End Read Merger (PEAR) para fusionar lecturas y el algoritmo de alineación DIAMOND (versión 0.9.12)62,65 para alinearse con las bases de datos RefSeq, SEED Subsystem y CAZyme34,66.

Se utilizó HUMAnN328 para identificar cambios en la expresión génica a partir de lecturas metatranscriptómicas y metagenómicas limpias. Las lecturas se alinearon con las bases de datos UniProt/UniRef 2019_01 para identificar la expresión de reacciones y MetaCyc para identificar la expresión de vías. Se utilizó MetaPhlAn 3.028 y la base de datos del pangenoma ChocoPhlan para clasificar las lecturas en especies bacterianas. Las lecturas que se alinean con reacciones y vías se normalizan según la cobertura de secuenciación y se informan como copias por millón (cpm, Copm) en las muestras metatranscriptómicas y metagenómicas.

El potencial redox se midió de acuerdo con un protocolo modificado67 de 32,40,41 con un electrodo de referencia Ag/AgCl (Radiómetro analítico E21M002, electrodo de placa Radiometro Analítico Pt M241 Pt de 5 × 5 mm) y un voltímetro. Los contenidos cecales congelados instantáneamente y liofilizados se rehidrataron primero en una proporción de 1:10 en agua RO y se agitaron durante 10 minutos con descansos de 10 minutos durante 60 minutos. Las muestras fueron cegadas y medidas en orden aleatorio. Luego, estos extractos se usaron para medir eH y pH dentro de las 24 h (Fig. 4) o 96 h (Fig. complementaria 9g-i). Cada muestra se agitó durante un minuto más antes de la medición. Se utilizó una placa de agar KCL 0,1 M como base para las muestras. Se insertó una punta de pipeta de plástico cortada en el agar para contener 300 µl del extracto cecal. El electrodo de platino se insertó en la muestra y el electrodo de referencia se insertó en el agar KCL 0,1 M. Se permitió que el potencial redox se estabilizara durante 20 min (Fig. 4) o 15 min (Fig. complementaria 9g-i) antes de registrar el voltaje. Los electrodos se limpiaron entre cada medición y se colocaron en la solución de limpieza RENOVO (Hach, Loveland, CO, EE. UU.) durante 1 min. Luego se enjuagó el electrodo con agua RO y se usó para medir una solución tampón redox de 220 mV para validar la integridad del electrodo antes de medir la siguiente muestra. Los mismos extractos cecales se utilizaron para medir el pH utilizando un medidor de pH y para su posterior validación con ensayos de ATP, secuenciación de ARNr 16S y carga bacteriana qPCR.

Se utilizaron extractos cecales de las mediciones de eH y pH para medir ATP con el ensayo de viabilidad celular microbiana BacTiterGlo (Promega, Madison, WI, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. También se midió una curva estándar en cada ensayo para validar los métodos de ensayo.

La PCR cuantitativa para la determinación de la carga bacteriana se realizó como se describió anteriormente en Vasihnava et al. Análisis Q-PCR de ADN genómico bacteriano utilizando iTaq Master Mix (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.) y cebadores universales del gen 16S rRNA. Se construyó un estándar con referencia al ADN bacteriano clonado correspondiente a una sección de 179 pb del gen 16S rRNA que se amplificó utilizando cebadores específicos de 16s RNA. Los valores Sq se normalizaron según la cantidad de ADN en la muestra.

Después del sacrificio de los animales, se obtuvo sangre completa mediante punción cardíaca y se colocó en un tubo de microcentrífuga para coagular durante 30 minutos. Luego, los tubos de recolección se centrifugaron a 13.000 × g durante 10 minutos para separar el suero, que luego se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga y se congeló a -80 °C hasta su posterior procesamiento. Cuando estuvieron listas, las muestras se descongelaron en hielo y se dividieron en una alícuota de trabajo y una alícuota de reserva nuevamente congelada. La alícuota de trabajo se analizó en busca de signos de inflamación en ratones utilizando el kit de citometría de flujo LEGENDplex Mouse Inflammation Panel (13-plex) (BioLegend, San Diego, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron en el citómetro de flujo Attune NxT (ThermoFisher, Waltham, MA) y luego se evaluaron utilizando la herramienta de software en la nube LegendPlex (BioLegend, San Diego, CA).

Los detalles específicos de los análisis estadísticos de todos los experimentos se describen en las leyendas de las figuras y en la sección Resultados. Todos los números de muestra representan réplicas biológicas. PERMANOVA se calculó utilizando el método de Adonis en matrices de distancia de Bray-Curtis calculadas a partir de un escalado multidimensional de datos de secuenciación utilizando phyloseq. Las muestras de control se compararon con los antibióticos tratados en cada grupo para determinar el tamaño del efecto del antibiótico. Se utilizó LEfSe (versión 1.0) para analizar los resultados de HUMAnN3 en el servidor web Galaxy usando la configuración predeterminada (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy). Los resultados metatranscriptómicos generados por SAMSA2 se sometieron a pruebas de abundancia diferencial utilizando el paquete DESeq2 (1.24.0) en R (versión 3.5.2) bajo parámetros predeterminados e incluyeron contraste: comparaciones de interacción68. Todos los resultados de DESeq2 se corrigieron utilizando el método de Benjamini-Hochberg (FDR = p-adj) para tener en cuenta las pruebas de hipótesis múltiples. ANOVA, pruebas t no pareadas y pruebas U de Mann-Whitney y Kruskal Wallis se realizaron en Prism GraphPad (versión 9.0) sin estimación del tamaño de la muestra. MaAsLin2 se utilizó para identificar anotaciones significativas de vías y reacciones a partir de resultados de HUMAnN3. FDR = −log(qval).

Los datos de secuenciación metagenómica y metatranscriptómica de lectura corta generados en este estudio se han depositado en la base de datos NCBI SRA. Los genomas ensamblados en metagenoma (MAG) se han depositado en NCBI GenBank. Los datos de secuenciación de 16s se han estado depositando en NCBI SRA. El código de acceso de BioProject para todas las secuencias asociadas con este estudio es PRJNA984334. Los resultados de DESeq2, LDA y MaAsLin2 generados en este estudio se proporcionan en la Información complementaria. Los datos de origen contienen toda la información estadística de PERMANOVA. Bases de datos utilizadas en este estudio (MMTV, acceso NC_001503), (MOV, acceso NC_001506.1), bases de datos de ARN ribosómico SILVA 128 LSU y SSU Parc (https://www.arb-silva.de/documentation/release-128), RefSeq (https://doi.org/10.1093/nar/gkt1274.), Subsistema SEED (https://doi.org/10.1093/nar/gkt1226), bases de datos CAZyme (https://doi.org/10.1093/nar /gkn663), bases de datos UniProt/UniRef 2019_01 (https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btm098), base de datos SILVA 132 99% (https://www.arb-silva.de/download/archive/qiime). Los datos originales se proporcionan con este documento.

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SP, BJK recibieron el apoyo del Programa de becas de investigación para graduados de la Fundación Nacional de Ciencias con el número de premio 1644760. PB recibió el apoyo del Centro Nacional de Salud Complementaria e Integrativa con el número de premio (R21 AT010366) y del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Enfermedades Renales (R01 DK125382). Las agencias de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño y preparación de este manuscrito. También nos gustaría agradecer a Realbiotech CO., Ltd (Choong-gu, Seúl, República de Corea) por su generosa donación de fibra purificada de levano. Este estudio utilizó el núcleo de investigación de histología, patología e imágenes respaldado por el Centro de Cáncer DHHS/NCI (P30CA16672) y recursos computacionales del Centro de Computación y Visualización de la Universidad de Brown. Las agencias de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación, el análisis o la interpretación de los datos. Las opiniones e interpretaciones presentadas aquí no son representativas de la posición de las agencias de financiación.

Departamento de Microbiología e Inmunología Molecular, Universidad de Brown, Providence, RI, 02912, EE. UU.

Swathi Penumutchu, Benjamin J. Korry y Peter Belenky

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Katharine Hewlett

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Conceptualización y Metodología: SP y PB Análisis formal: SP, KH, Investigación: SP, BJK, Curación de datos: SP; Redacción- borrador original: SP y PB; Escritura-revisión y edición: SP y PB; Validación estadística: SP; Visualización: SP; Supervisión: PP; Adquisición de financiación: PB

Correspondencia a Peter Belenky.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Penumutchu, S., Korry, BJ, Hewlett, K. et al. La suplementación con fibra protege de la disbiosis del microbioma intestinal inducida por antibióticos al modular el potencial redox intestinal. Nat Comuna 14, 5161 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40553-x

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Recibido: 11 de mayo de 2023

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 24 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40553-x

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